Agarose-Gelelektrophorese

ist eine molekularbiologische .html">Desoxyribonukleinsäure (DNS) .html"> (Gelelektrophorese) funktioniert wie ein Sieb .html"> (elektrisches Feld) wird verwendet, um die negativ geladenen DNS-Moleküle durch die Gel | (Gel)matrix zu ziehen, wobei die kleineren DNA-Moleküle sich schneller durch das Gel bewegen können.

Material

Für die Agarose-Gelelektrophorese werden benötigt:
  • Die DNS, die nach ihrer Größe aufzutrennen ist.
  • Eine DNS-Leiter | (DNS-Leiter), eine Mischung verschiedener DNS-Stränge bekannter Länge, mit der die DNS-Probe verglichen werden kann, um deren Größe zu bestimmen. DNS-Leiter sind kommerziell erhältlich.
  • TBE | (TBE)-Puffer, 0.5×, pH 8.0
  • EDTA | (EDTA), 0.5M, pH 8.0
  • Agarose | (Agarose)
  • Ethidiumbromid | (Ethidiumbromid) (5.25 mg/ml in H2O
  • Ein Farbmarker, z.B. ein niedermolekularer Farbstoff wie Bromphenol Blau | (Bromphenol Blau), um den Fortschritt der Elektrophorese abschätzen zu können.
  • Eine Gelkammer.
  • Ein "Kamm" (normalerweise aus Teflon | (Teflon).

    Vorbereitung

    # Herstellung einer 1% Agaroselösung in TBE; für kleine DNS-Fragmente bis zu 2%. Volumen 15-70 ml, je nach Größe des Gels. # Agarosegellösung kochen, normalerweise in der Mikrowelle | (Mikrowelle). # Die Lösung bei Raumtemperatur bis auf ca. 60 °C abkühlen lassen, dabei stetig rühren. # 1 ml Ethidiumbromid pro 10 ml Gellösung dazugeben. Vorsicht: Ethidiumbromid ist mutagen | (mutagen)! # Die Lösung rühren, bis sich das Ethidiumbromid gut verteilt hat, dann in die Gelkammer gießen. # Den Kamm auf einer Seite des Gels hineinstecken, ca. 5-10 mm vom Rand entfernt. # Wenn das Gel fest geworden ist, den Kamm entfernen. Die Löcher, die im Gel zurückbleiben, werden ''Slots'' genannt. # Das Gel in 0,5× TBE-Laufpuffer legen. Das Gel muss vollständig bedeckt sein. Die Slots müssen an der negativen Elektrode der Kammer zu liegen kommen. # Den Farbmarker zu den DNS-Proben hinzugeben. DNS-Leiter enthält für gewöhnlich schon Farbmarker.

    Prozedur

    DNS-Leiter und -Proben in jeweils einen Slot spritzen (bis zu 25 µl. Elektrische Spannung anlegen, normalerweise 100 Volt | (Volt) für 30 Minuten mit einem 15 ml-Gel. Wenn die "Farbfront" das Gel verlässt, Elektrophorese beenden. Schematische Darstellung der Elektrophorese # Das Agarosegel mit 3 Slots (S. # Einspritzen von DNS-Leiter in den ersten Slot. # DNS-Leiter ist injiziert. Proben 2 und drei werden eingespritzt. # Eine Spannung wird angelegt. Die DNS wandert zur positiv gelagenen Anode .html"> (Phosphat)reste im "Rückgrat" der DNS. # Kleine DNS-Fragmente wandern schnell, große langsam durch das Gel. Die DNS ist währenddessen normalerweise nicht sichtbar. Daher wird der Fortschritt an der Farbfront abgelesen, die sich schneller als selbst kleinste DNS-Fragmente durch das Gel bewegt. # Die Farbfront hat das Ende des Gels erreicht, die Elektrophorese ist komplett. Das Gel kann unter einer UV-Lampe .html">fluoresziert .html"> (ultraviolett)en Licht (Gesichtsschutz tragen!. Eine DNS-Bande kann aus dem Gel ausgeschnitten und die DNS zur weiteren Verwendung gereinigt werden. :''Siehe auch:'' SDS-PAGE | (SDS-PAGE)
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